活體單細胞顯微技術(shù)成像可實時表征基于單細胞水平的生理變化，有助于揭示組織間的信號傳輸機制和細胞相互作用，對于預(yù)測和調(diào)控疾病進展至關(guān)重要的。然而，基于傳統(tǒng)的可見和近紅外光（NIR-I，<900 nm）顯微成像面臨嚴重的光衰減問題，活體顯微通常需要在成像部位進行手術(shù)以暴露目的組織。然而這種手術(shù)開窗輔助成像不可避免地會改變局部血管通透性，誘發(fā)皮膚、肌肉或顱骨等組織炎癥，誘發(fā)成像區(qū)域組織的微環(huán)境變化。

為此，某大學(xué)教授研究團隊率先開發(fā)了基于近紅外第二窗口熒光（NIR-II，~1500 nm）的活體無創(chuàng)顯微技術(shù)。張凡教授*發(fā)表的Nature Protocols論文詳細介紹了如何利用NIR-II納米熒光探針進行活體顯微成像，以避免在活體組織中的衰減，從而實現(xiàn)對深腦組織中的單細胞動態(tài)追蹤，采用光學(xué)性能優(yōu)異的稀土納米探針ErNPs和TmNPs標記活體中的中性粒細胞，實現(xiàn)了對腦卒中小鼠腦皮層中中性粒細胞無創(chuàng)動態(tài)可視化和遷移行為分析。在這篇文章中，研究團隊詳細介紹了NIR-II顯微成像用于活體動態(tài)細胞追蹤的實驗方案（圖1），從NIR-II納米熒光探針的設(shè)計合成與表征，多通道NIR-II顯微成像設(shè)備的靈活搭建，活體標記細胞，NIR-II活體顯微成像實驗的前期準備與實時成像操作，數(shù)據(jù)分析等多方面進行了詳細的介紹。

圖1. 近紅外二區(qū)活體熒光顯微成像技術(shù)的工作示意圖

  其中，團隊利用開發(fā)的*近紅外二區(qū)稀土熒光探針特異性的標記了小鼠的中性粒細胞以研究炎癥血管中活化中性粒細胞的體內(nèi)成像（圖2）。中性粒細胞能夠在血管內(nèi)壁爬行到外滲部位，然后外滲是中性粒細胞活化的典型特征。CD11b是一種介導(dǎo)細胞粘附和遷移的中性粒細胞表面蛋白，在活化的中性粒細胞表面表達上調(diào)。中性粒細胞上Ly6G和CD11b蛋白的雙重標記有助于在體內(nèi)特異性地跟蹤活化的中性粒細胞。因此，在缺血性腦卒中小鼠模型中，靜脈注射抗ly6g抗體偶聯(lián)的α-TmNPs和抗cd11b抗體偶聯(lián)的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)，標記活化的中性粒細胞，雙標記的中性粒細胞表現(xiàn)出微弱的運動、滾動和爬行，表明它們在內(nèi)皮細胞表面粘附牢固。此外，可以觀察到雙標記的中性粒細胞，沿著血流的剪切力被拉長，這通常被認為是中性粒細胞通過炎癥血管外滲的*一步。

圖2. 炎癥血管中活化中性粒細胞的體內(nèi)成像。

    *，本文對基于NIR-II熒光活體顯微設(shè)備和技術(shù)的適用范圍和應(yīng)用前景進行了結(jié)與展望，致力于將NIR-II熒光顯微技術(shù)推廣于腦科學(xué)、感染科學(xué)、免疫與炎癥、腫瘤、干細胞等生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的基礎(chǔ)研究應(yīng)用中。

參考文獻：

Ying Chen, Yiwei Yang, and Fan Zhang*. Noninvasive In Vivo Microscopy of Single Neutrophils In The Mouse Brain Via NIR-II Fluorescent Nanomaterials. Nature Protocols, 2024. DOI: doi.org/10.1038/s43-3.

| 儀器

近紅外二區(qū)顯微成像系統(tǒng)M-NIR-II

NIR-II microscopic imaging system

文中中性粒細胞活體追蹤的成像實驗均采用近紅外二區(qū)顯微成像系統(tǒng)M-NIR-II進行的。該M-NR-II系統(tǒng)相機性能優(yōu)異，具有三種深度制冷的InGaAs近紅外相機可供用戶自由選擇。配備多款不同倍數(shù)的物鏡，能夠實現(xiàn)多種微區(qū)視野高信噪比活體成像。可選配多重波長激光器、X射線、近紅外LED等多種激發(fā)光源。可搭配多個相機，動態(tài)實時示蹤活體多種不同標記物。開發(fā)的軟件功能一鍵操作，可實現(xiàn)圖像采集與處理一體化，圖像處理功能強大，終身免費升級。該系統(tǒng)可應(yīng)用于腫瘤局部成像、微血管造影、細胞染色實驗、活體細胞示蹤、免疫細胞互作機理研究、癌細胞遷移以及病理切片分析等。